Выбор языка |
Главная О КНТС Новости Программы Направления исследований Эксперименты Результаты Информационные ресурсы Приём заявок
Шифр эксперимента: Структура
Направление НПИ: 4. Космическая биология и биотехнология
Секция КНТС: 1. Космическая биология и физиология
Наименование эксперимента: Получение высококачественных кристаллов рекомбинантных белков.
Цель эксперимента:

Исследование физических процессов кристаллизации белков для получения совершенных по структуре монокристаллов белков, пригодных для рентгеноструктурного анализа и расшифровки их структуры в интересах фундаментальной науки, медицины и биотехнологии.

Описание эксперимента:

Космический эксперимент «Структура» посвящен исследованию физических процессов кристаллизации белков для получения совершенных по структуре монокристаллов белков, пригодных для рентгеноструктурного анализа и расшифровки их структуры в интересах фундаментальной науки, медицины и биотехнологии.

Современные подходы к созданию эффективных лишенных побочных явлений лекарственных диагностических и профилактических препаратов основаны на использовании методов молекулярного моделирования фармакологически активных соединений, соответствующих биологической мишени организма. Знание пространственной структуры биомолекулы в сочетании с физико-химическими данными позволяют наиболее полно моделировать ее структурно-функциональные особенности. Анализ пространственной структуры дает информацию по активному центру, по эффективности конструкции белка, и позволяет внести необходимые изменения в структуру искусственно создаваемых белков для повышения биологической их активности. Структурные исследования проводятся на кристаллических формах с использованием методов рентгеноструктурного анализа, результаты которого позволяют изучать третичную структуру белков, определять механизм их действия и особенности синтеза.

Для проведения рентгеноструктурного анализа нужны крупные, размером не менее 0,3-0,5 мм по каждому направлению качественные кристаллы. Кристаллы меньшего размера (0,03- 0,2 мм) изучаются с помощью источника синхротронного излучения, возможности использования которого в настоящий момент в России ограничены. Несмотря на достигнутый значительный прогресс в технике выращивания кристаллов белков, не все белки удается закристаллизовать с необходимыми для рентгеноструктурных исследований характеристиками в лабораторных условиях. Одним из перспективных направлений для решения проблемы кристаллизации белков является использование эффекта микротяжести, которое возникает на борту космического аппарата при его движении по орбите и позволяющее исключить конвективные потоки в растворах гравитационного происхождения.

Новизна эксперимента:

Предлагаемые эксперименты оригинальны и в настоящий момент не имеют зарубежных аналогов, кроме совместного российско-японского КЭ «Кристаллизатор», где используется метод встречной диффузии, что не позволяет получать кристаллы больших размеров, превышающих размеры капилляра (диаметр - 1 мм). НА «Луч-2», используемая в КЭ«Структура», является оригинальной разработкой отечественных конструкторов. Для кристаллизации будут использоваться оригинальные белки, сконструированные отечественными учеными.

Научная аппаратура:

С 2008 по 2011 гг. в КЭ использовался кристаллизатор «Луч-2» разработки НПП «БиоТехСис», который также использовался для проведения КЭ «Миметик-К», «Вакцина-К», «КАФ», «Интерлейкин К», «Гликопротеид-К».

Универсальная биокристаллизационная кассета (УБК) «Луч-2» предназначена для выращивания монокристаллов биологических препаратов методом диализа через полупроницаемую мембрану или комбинированным методом диализа и диффузии через газообразное состояние. Оба реализуемых в УБК «Луч-2» метода направлены на постепенное изменение концентрации осаждающего агента в камерах с раствором биологического препарата с целью достижения условий образования его монокристаллов. Укладка "Луч-2", состоит из шести универсальных биокристаллизационных кассет (рис. 1), каждая из которых включает в себя четыре кристаллизационные ячейки и механический привод. Каждая ячейка имеет три белковых камеры. После доставки научного оборудования на РС МКС с помощью механического привода космонавт запускает процесс кристаллизации белков и по окончании эксперимента прекращает его.

В период с 2003 по 2008 гг. УБК «Луч-2» использовалась для проведения целого ряда КЭ по кристаллизации белков – «Вакцина-К», «Гликопротеид-К», «Интерлейкин-К», «Миметик-К», «КАФ».

Более подробное описание НА «Луч-2» можно найти в разделах, посвященных КЭ «Вакцина-К», «Гликопротеид-К», «Интерлейкин-К», «Миметик-К», «КАФ».

Рисунок 1 – Общий вид кристаллизационной кассеты и укладки универсального биокристаллизатора «Луч-2».

В ходе проведения КЭ «Структура» в УБК «Луч-2» отмечалось достаточно сильное высыхание капель в кристаллизационных ячейках. В предыдущих КЭ по кристаллизации белков («Вакцина-К», «Гликопротеид-К», «Интерлейкин-К», «Миметик-К», «КАФ»), проводившихся с использованием аппаратуры «Луч-2», также наблюдалось уменьшение объема жидкости в кристаллизационных ячейках. Поскольку диффузионные утечки критическим образом влияют на процессы образования и роста кристаллов, при подготовке КЭ в период МКС-18 – 22 верхние металлические крышки кристаллизационных камер кассет были заменены на сплошные (без смотровых окон). Был также сделан вывод, что утечки жидкости, приводившие к существенному пересыханию белковых камер УБК в период МКС 18 – 22, были вызваны старением материала пластмассового корпуса кассет УБК и появлению в нем микротрещин.

Начиная с экспедиции МКС-27 (2011 год) для проведения КЭ «Структура» используется глубоко модернизированная аппаратура «Луч-2М», пришедшая на смену физически износившимся приборам «Луч-2». Проведены доработка НА и проверка эффективности принятых мер на модельных белках, которые хорошо кристаллизуются на Земле (лизоцим, инсулин). Однако первый запуск, произведенный с этой аппаратурой показал, что, несмотря на принципиально прежнее устройство прибора, внесенные конструктивные изменения привели к малопредсказуемым отрицательным результатам. Поэтому основной целью КЭ «Структура» в 2012 году было проведение контрольных экспериментов и технологической отработки аппаратуры «Луч-2М» с целью выявления и исправления конструктивных недостатков и оптимизации протокола использования прибора.

Использование модельных белков в качестве положительных контролей при проведении КЭ «Структура» в период МКС-29, МКС-31 и МКС-33 показало принципиальную пригодность аппаратуры «Луч-2М» для проведения КЭ.

Ожидаемые результаты:

Высококачественные кристаллы белков Получение сведений о структуре сайт-специфических регионов лигандов и рецепторов позволят предсказать структуры агонистов и антагонистов и синтезировать пептиды, несущие основные свойства белков, но не вызывающие побочных эффектов, присущих целым молекулам.

Полученные результаты:

КЭ был начат в 2008 г. В период с МКС-18 по МКС-33 проведено восемь сеансов КЭ.

В период экспедиций МКС-18 – МКС-27 в результате проведенных 5 сеансов КЭ не удалось получить кристаллы белков, пригодные для проведения рентгеноструктурного анализа. Для исследований были использованы следующие белки:

- рекомбинантный гамма-интерферон (МКС-18 – МКС-25);

- комплекса рекомбинантного инсулина человека с полисиаловой кислотой МКС-18, -21, -22);

- соматотропин (МКС-21, -25, -27);

- рекомбинантный альфафетопротеин rhAFP, очищенный от лигандов (МКС-21, -25, - 27);

- рекомбинантный альфафетопротеин rhAFP в комплексе билирубином (МКС-21, -25, - 27);

- рекомбинантный муралитический фермент фага (МКС-21, -25, - 27);

- рекомбинантный фибриллярный адгезин фага phiKZ (МКС-21, -25, - 27).

В качестве объектов для кристаллизации на РС МКС в период МКС-29 – МКС-31 были отобраны белки:

- рекомбинантный альфа-фетопротеин («АФП»);

- рекомбинантный муралитический фермент фага Т5 (Т5mur);

- рекомбинантный инсулин человека в комплексе с полисиаловой кислотой INCA23 (Cиалоинсулин))

- высокоочищенный лизоцим куриного яйца (Лизоцим).

Уменьшение количества задействованных в КЭ белков по сравнению с экспедициями 2011 г. и ранее обусловлено отрицательным результатом КЭ «Структура» в период МКС-27. Проведенный анализ и моделирование эксперимента в наземных условиях показал, что большинство причин неудачи объясняется конструктивными отличиями аппаратуры «Луч-2М» от ранее использовавшейся аппаратуры «Луч-2». Было принято решение до полного выявления всех особенностей работы УБК «Луч-2М» и внесения необходимых корректив в протоколы подготовки и заправки кристалализационных ячеек изъять из космического сегмента эксперимента «Структура» наиболее сложные и дорогостоящие белковые препараты (Адгезин, Соматотропин, АФП – билирубин) и ввести в эксперимент положительные контроли, условия кристаллизации которых известны и имеют широкий диапазон (Сиалоинсулин и Лизоцим). Для остальных белковых препаратов, внесенных в список КЭ «Структура» предполагается временно ограничиться поиском вариантов различных составов осаждающих агентов с целью получения более качественных монокристаллов биопрепаратов в наземных условиях.

Результаты КЭ, полученные в период МКС-29 и МКС-31 приведены в таблицах 1 и 2.

В ячейке белковой камеры №2 УБК № 2 (МКС-29), содержащей препарат рекомбинантного альфа-фетопротеина человека, очищенного от лигандов (AFPdef), на фоне аморфного осадка наблюдается образование двух удлинненных кристаллов размером примерно 2х20 и 5х70 мкм с нерегулярной волокнистой структурой (Рис.2).

Рис. 2. Результаты КЭ «Альфафетопротеин» в период МКС-29. Микровидеоизображение содержимого орбитальной кристаллизационной ячейки (УБК № 2, кам. 2), обычное освещение.

Таблица 1 - Обзор результата КЭ «Структура» в период МКС-29.

Таблица 2 - Обзор результата КЭ «Структура» в период МКС-31.

Для белка T5Mur кристаллы белков в период МКС-29 получены не были. В связи с этим в период экспедиции МКС-31 белки AFP и T5Mur не использовались в заправке.

Препарат «Сиалоинсулин». В ячейках УБК, содержащих препарат комплекса рекомбинантного инсулина человека с полисиаловой кислотой, наблюдалось образование большого количества некрупных (в среднем 50х50х50 мкм) кубических кристаллов или их осколков (рис.3). Подобная картина со сравнимым размером кристаллов наблюдалась в контрольном наземном эксперименте, что соответствует ранее полученным результатам (КЭ «Структура» в период МКС 15-18).

МКС-29. Микровидеоизображение содержимого орбитальной кристаллизационной ячейки (УБК № 3, кам. 1), обычное освещение.

МКС-31. Микровидеоизображение содержимого орбитальной кристаллизационной ячейки (УБК № 1, кам. 2), обычное освещение.

Рис. 3. Результаты КЭ «Сиалоинсулин» в период МКС-29 и МКС-31.

Препарат «Лизоцим». При проведении КЭ «Структура» в период МКС-29 в ячейках УБК, содержащих препарат высокоочищенного лизоцима куриного яйца, на фоне аморфного осадка наблюдалось образование довольно крупных в среднем 50х30х200 мкм) параллелепипедных или ромбических кристаллов (рис.4).

МКС-29. Микровидеоизображение содержимого орбитальной кристаллизационной ячейки (УБК № 4, кам. 1), обычное освещение.

МКС-31. Кристаллы, образовавшиеся на стенках белковой камеры (УБК № 3, кам. 2), поляризованное освещение.

МКС-31. Гексагональный плоский кристалл, образовавшийся на крышке белковой камеры (УБК № 4, кам. 4), поляризованное освещение.

Рис. 4. Результаты КЭ «Лизоцим» в период МКС-29, МКС-31, МКС-33.

Было обнаружено, что образующиеся кристаллы лизоцима склонны прилипать к диализной мембране в ячейке. В ходе наземных и космических экспериментов с препаратом лизоцима проводились работы по подбору подходящего материала диализной мембраны и условий кристаллизации, так была показана неудовлетворительная устойчивость мембраны к пониженному рН растворов, наблюдалась заметная деформация мембранной пленки, вплоть до образования сквозных изломов. В результате образование кубических и гексагональных кристаллов происходило преимущественно на боковых стенках камеры (рис.4). Образующиеся кристаллы были мелкими и/или неправильной формы и для рентгеноструктурного исследования непригодны. Был сделан вывод, что если кристаллизация исследуемого белка происходит при условиях, сильно отличных от физиологических (экстремальный рН, высокая ионная сила итп), будет требоваться подбор материала применяемой во вкладыше диализной мембраны по ее гидрофобности, пористости и химической стабильности.

Сроки проведения: КЭ был начат в 2009 году. Сеансы КЭ проводились во время экспедиций МКС-18, МКС-21, МКС-22, МКС-25, МКС-29, МКС-31, МКС-33.
Состояние эксперимента: Реализуется
Организация постановщик: ОАО «Биопрепарат»
Организации участники: Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН НПП «БиоТехСис» ОАО РКК «Энергия» им С.П.Королева ФГБУ НИИ ЦПК им. Ю.А.Гагарина
Научный руководитель: Щербаков Г. Я., ОАО «Биопрепарат», начальник Научно-технического управления, д.м.н., профессор
Публикации по эксперименту:

Список публикаций в процессе редактирования.

Последнее обновление: 17.11.2017

Информационная справка

Программы

Изображения