Выбор языка |
Главная О КНТС Новости Программы Направления исследований Эксперименты Результаты Информационные ресурсы Приём заявок
Шифр эксперимента: Конъюгация
Направление НПИ: 4. Космическая биология и биотехнология
Секция КНТС: 1. Космическая биология и физиология
Наименование эксперимента: Отработка процесса передачи генетического материала методом конъюгации бактерий
Цель эксперимента:

Разработка методов конструирования новых рекомбинантных штаммов-продуцентов актуальных для медицины белков, используя технику бактериальной конъюгации и мобилизации плазмид при конъюгации в условиях орбитального полета.

Описание эксперимента:

Основным фактором воздействия условий космического полета на живые организмы является отсутствие гравитационно-обусловленных видов конвекции - термоконвекции, концентрационной и плотностной конвекции, а также седиментации клеток. В то же время нельзя пренебрегать другими факторами орбитального полета, в частности, движением клетки в геомагнитном поле и космическое излучение. В результате отсутствия конвекционного перемешивания резко увеличивается толщина "не перемешиваемых слоев" в интерфазах между внешней мембраной и объемом среды и между цитоплазматической мембраной и цитоплазмой. Слабая связь пилей (цитоплазматических мостиков) донора с поверхностью клетки реципиента при конъюгации, сами пили, а также непрочные липид-белковые мостики между сливающимися мембранами соседних клеток при слиянии протопластов менее подвержены разрушению благодаря отсутствию конвекции и седиментации (остается только броуновское движение), что должно повышать выход гибридных клеток в условиях космического полета. В случае регенерации протопластов после слияния дополнительный положительный эффект, по-видимому, дает отсутствие повреждающего воздействия конвекции, седиментации и плотностных эффектов на цитоплазматическую мембрану в ходе роста новой клеточной стенки.

Биотехнологический эксперимент «Конъюгация» на борту МКС посвящен разработке методов конструирования новых рекомбинантных штаммов-продуцентов БАВ, путем переноса плазмидных и хромосомных ДНК при бактериальной конъюгации и предусматривает объединение в емкости биореактора жидких культур штаммов донора и реципиента в условиях орбитального полета с последующим генетическим анализом полученных культур и наземной селекцией стабильных гибридов.

Новизна эксперимента:

Данные об эффективном переносе полной бактериальной хромосомы и образовании относительно стабильного гетерозиготного диплоидного состояния при бактериальной конъюгации, а также о регенерации протопластов в жидкой среде и о слиянии протопластов в условиях орбитального полета оригинальны. Работ по использованию методов бактериальной конъюгации и слияния протопластов в условиях орбитального космического полета для получения новых гибридных штаммов микроорганизмов в России и за рубежом не проводилось.

Научная аппаратура:

КЭ «Конъюгация» осуществляется в гибридизаторе «Рекомб-К» (рис.1), содержащем три емкости, отделенных друг от друга клапанами, обеспечивающими возможность только односторонней передачи биоматериала: в направлении от емкости 1 к емкости 3. В емкость 1 заправляется 2 мл клеток реципиента, суспендированного в свежей питательной среде; в емкость 2 – 1,5 мл клеток донора, суспендированного в свежей питательной среде с фактором концентрирования в 10 раз; в емкость 3 – селективную питательную среду, содержащую антибиотики, CuSO4 и др.

Все операции по заправке выполняются в боксированных помещениях с соблюдением правил асептики.. Хранение и доставка заправленных биореакторов осуществляется в охлажденном состоянии (2-8°С), чтобы максимально сохранить жизнеспособность биоматериала. Исключением являются периоды доставки аппаратуры «Рекомб-К» с космодрома на МКС и возвращения на Землю, в которые аппаратура вынужденно находится при температуре окружающей среды.

Аппаратура «Рекомб-К» имеет массу 0,3 кг и габариты 115?105?60 мм.

Манипуляции по конъюгативному скрещиванию штаммов донора и реципиента осуществляются на РС МКС в момент, предусмотренный согласованной циклограммой КЭ «Конъюгация». При бортовой реализации КЭ выполняются следующие операции:

- термостатирование гибридизатора при комнатной температуре в течение 30 мин;

- по окончании термостатирования выполняется перетеснение 0,5 мл культуры реципиента из емкости 1 в емкость 2, затем перемешиваются культуры донора и реципиента 2-3-кратными плавными оборотами колеса А (рис.1);

- инкубирование гибридизатора в течение 2 ч 30 мин при 30?С;

- по окончании экспозиции конъюгационную смесь тщательно перемешивают резкими многократными поворотами колеса А и выполняется перетеснение 1,5 мл конъюгационной смеси из емкости 2 в емкость 3.

Рисунок 1. Гибридизатор „Рекомб-К”: общий вид (слева), схема (справа).

По окончании экспериментальных процедур гибридизатор переноситя в холодильник и хранится на борту МКС» до возвращения на Землю.

Ожидаемые результаты:

Исследования позволят разработать методы получения гибридных штаммов продуцентов биологически активных веществ путем переноса плазмидных и хромосомных ДНК при бактериальной конъюгации. Внедрение полученных в ходе работы рекомбинантных штаммов-продуцентов в производство Гос.НИИ ОЧБ и последующее применение разработанной методологии для получения новых штаммов – продуцентов БАВ и их использование на других предприятиях отрасли может дать значительный экономический эффект.

Полученные результаты:

КЭ начат в 2003 г. В период МКС-7, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, - 19/20, - 21/22, - 23/24, -27, -33 проведено 14 сеансов КЭ.

В результате проведенных в период МКС-7 – МКС-21 сеансах КЭ была продемонстрирована мобилизация рекомбинантной плазмиды, контролирующей синтез эпидермального фактора роста человека (ЭФР), при конъюгативном скрещивании донора и реципиента

Была продемонстрирована экспрессия гена ЭФР в отобранных линиях конъюгантов. В ходе наземной селекции из биоматериала, полученного в КЭ, удалось выделить чистую линию штамма Escherichia coli BL21(DE3)::Tn5 (KmR)/F?; pEThEGFOriT, продуцируюшую значительные количества ЭФР и поддерживающую это свойство при хранении и культивировании штамма.

Полученные данные подтвердили, что метод мобилизации рекомбинантных плазмид при бактериальной конъюгации в КЭ позволяет получать бактериальные штаммы-продуценты с уровнем биосинтеза целевого продукта, достаточно высоким для практического применения. Для подтверждения универсальности данного методического подхода, а также для приближения результатов исследования к практике для исследований в период МКС 24 и МКС-27 был выбран целевой белок, уже применяемый в научно-практической деятельности. В качестве такого белка был выбран Cu,Zn-супероксидисмутазу человека (СОД).

Дополнительным преимуществом СОД является то, что ранее были сконструированы рекомбинантные плазмиды, контролирующие синтез CОД в E.coli: pET-SOD7 и pEThSODoriT, и которые были предоставлены ООО «Протеиновый контур» для проведения данных исследований. Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pET-SOD7, полученный методом генетической трансформации, подготовлен для использования в проводимом параллельно КЭ «ОЧБ».

В результате реализации двух сеансов КЭ «Конъюгация» в период МКС-24 и МКС-27 был успешно осуществлен перенос двух рекомбинантных плазмид, кодирующих один целевой белок – Cu,Zn-супероксиддисмутазу человека (СОД): pEThSODoriT и pLhSODoriT. Рекомбинантные плазмиды различались по типу регуляции экспрессии гена СОД и, соответственно, по уровню спонтанного (неиндуцированного) синтеза СОД в соответствующем штамме-реципиенте.

Для осуществления КЭ «Конъюгация» были сконструированы пары штаммов донор и реципиент для каждого варианта плазмиды. Основное требование к штаммам-донорам – отсутствие экспрессии гена СОД, к реципиентам – контролируемый добавлением индуктора в питательную среду синтез СОД. Кроме того, донор и реципиент должны были нести различные селективные маркеры, отличные от маркера рекомбинантной плазмиды, чтобы была возможность отбирать гибриды в условиях избирательного подавления роста обоих исходных штаммов.

Из биоматериала, полученного при конъюгативном скрещивании в КЭ, несмотря на определенные технические трудности, были выделены все четыре возможных варианта гибридных клонов E.coli – продуцентов СОД: две группы в зависимости от штамма-реципиента и плазмиды и по два варианта гибридов в каждой группе: гибриды I-го типа, получившие в результате мобилизации только рекомбинантную плазмиду, и гибриды II-го типа, получившие дополнительно конъюгативную плазмиду F?. Продуктивные гибриды были выделены как из конъюгационной смеси (емкость 2 гибридизатора «Рекомб-К»), так и из жидкой селективной среды (емкость 3 гибридизатора).

Полученные результаты демонстрируют высокую надежность, воспроизводимость и универсальность метода мобилизации рекомбинантных плазмид при конъюгативном скрещивании в космосе, что может быть использовано в качестве метода получения рекомбинантных штаммов бактерий – продуцентов белков медицинского назначения.

Реализация КЭ «Конъюгация» позволила выявить ряд факторов, влияющих на продуктивность полученных гибридных штаммов, а именно:

- наличие плазмиды фертильности: в реципиенте E.coli BL21(DE3) ::Tn5 гибриды I-го типа, несущие только плазмиду pEThSODoriT, значительно продуктивнее гибридов II-го типа, получивших также плазмиду F?;

- генотип штамма-реципиента: в гибридах, полученных из реципиента E.coli G1724::Tn5, наличие плазмиды F? не влияет на продуктивность;

- уровень спонтанного синтеза целевого белка, обусловленный типом регуляции соответствующего гена на рекомбинантной плазмиде: первичные гибриды, полученные при моболизации плазмиды pLhSODoriT, конструкция которой обеспечивает более низкий уровень неиндуцированного синтеза СОД, значительно более продуктивны, чем соответствующие гибриды с плазмидой pEThSODoriT;

- особенности поведения рекомбинантного белка в бактериальной клетке: СОД, в отличие от большинства других рекомбинантных белков, не локализуется в виде «телец включения», а образует пространственный полимерный матрикс, мешающий клеточному делению. В результате имеет место явление «отрицательной автоселекции», ограничивающее продуктивность полученных продуцентов СОД. Мы полагаем, что преодолеть это явление можно путем выхода на гораздо более высокий уровень продуктивности, для чего разрабатываются специальные приемы селекции.

Полученная в результате реализации КЭ «Конъюгация» научная информация демонстрирует сложность выбора штаммов и конструкции рекомбинантных плазмид для получения высокопродуктивных гибридных штаммов. Полученные результаты позволяют осознанно подходить к конструированию штаммов донора и реципиента для конъюгативного скрещивания. Кроме того, полученная информация в значительной степени определяет стратегию наземной селекции высокопродуктивных вариантов штаммов-продуцентов из биоматериала, полученного в КЭ.

Задачей сеанса КЭ в период МКС-33 является, исходя из результатов, полученных в сеансах КЭ 2011 года, повторение эксперимента с той же парой донор: реципиент с целью подбора новых штаммов для получения линий гибридных бактериальных штаммов, представляющих собой исходный материал для селекции высокопродуктивных вариантов штаммов – продуцентов СОД человека.

Планируемый срок завершения бортовой реализации КЭ – 2015 г.

Сроки проведения: КЭ находится на этапе реализации, начат в 2003 г. КЭ «Конъюгация» планируется продолжить до 2015 года.
Состояние эксперимента: Реализуется
Организация постановщик: ОАО «Биохиммаш»
Организации участники: НПП «БиоТехСис», РКК «Энергия», ФГБУ НИИ ЦПК им. Ю.А.Гагарина.
Научный руководитель: Зеров Ю.П., ФГУП ГосНИИОЧБ, к.б.н.
Публикации по эксперименту:

Зеров Ю.П., Мурашев Б.В., Смирнова Г.В., Тихомирова В.П. Перенос плазмид при бактериальной конъюгации в условиях орбитального космического полета.// Космонавтика и ракетостроение.- 2007.- №4 (49),- с.95-102.

Последнее обновление: 17.11.2017

Информационная справка

Программы

Изображения