Выбор языка |
Главная О КНТС Новости Программы Направления исследований Эксперименты Результаты Информационные ресурсы Приём заявок
Шифр эксперимента: КАФ
Направление НПИ: 4. Космическая биология и биотехнология
Секция КНТС: 1. Космическая биология и физиология
Наименование эксперимента: Кристаллизация белка СаF1М и его комплекса с С-концевым пептидом СаF1 как основы для конструирования нового поколения антимикробных лекарственных препаратов и компонентов вакцин против иерсениозов
Цель эксперимента:

Проведение кристаллизации в условиях невесомости генноинженерного белка и его комплексов с пептидом с последующим получением данных для направленного создания новых лекарственных препаратов и вакцин против иерсениозов.

Описание эксперимента:

В ходе эксперимента проводится кристаллизация комплекса V-антигена с Toll-like-2 рецепторами (типа "колокола") в условиях космического полета. Toll-like-2 рецепторы являются мембранными белками, поэтому в земных условиях их кристаллы получить затруднительно. Преимуществом кристаллизации в условиях орбитального полета является микрогравитация, которая обеспечивает оптимальные условия для выращивания биокристаллов за счет отсутствия конвекционных потоков белкового вещества у поверхности выращиваемого кристалла. В дальнейшем изучалась пространственная структура полученных монокристаллов белков. Определение структуры комплекса имеет преимущественное значение для выяснения механизма проведения сигнала и индукции синтеза интерлейкина-10 в организме. В настоящее время предпринимаются попытки использовать рекомбинантный V-антиген в качестве основного компонента молекулярных вакцин нового поколения против иерсиниозов.

Объектом исследования был генно-инженерный молекулярный периплазматический шаперон Caf1 и комплекс Caf1 с синтетическим пептидом, соответствующим С-концевой области капсульного антигена Caf1A Yersinia pestis.

Эксперимент «КАФ» по кристаллизации белка и белкового комплекса проводился методом диффузии компонентов высаживающих агентов через газообразное состояние в варианте "висячей" капли.

Новизна эксперимента:

Кристаллогенез в условиях космоса (отсутствие гравитации) иммуноглобулин-подобного периплазматического молекулярного шаперона CaflM Yersiniapestis, прототипа членов субсемейства со сходными структурными и функциональными свойствами позволит получить кристаллы белка для рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением. Исследование кристаллов этого белка позволит получить данные о структуре и молекулярных механизмах CaflM и Cafl взаимодействия.

Научная аппаратура:

Для решения задач по выращиванию в космосе качественных кристаллов белков на основе отечественного и зарубежного опыта НПП «БиоТехСис» была разработана универсальная биокристаллизационная кассета (УБК) «Луч-2».

УБК «Луч-2» предназначена для выращивания монокристаллов биологических препаратов методом диализа через полупроницаемую мембрану или комбинированным методом диализа и диффузии через газообразное состояние. Оба реализуемых в УБК «Луч-2» метода направлены на постепенное изменение концентрации осаждающего агента в камерах с раствором биологического препарата с целью достижения условий образования его монокристаллов. Аппаратура «Луч-2» представляет собой два вкладыша Укладка № 1 и Укладка № 2. В каждой укладке уложены четыре универсальных биокристаллизационных кассеты (УБК) «Луч-2» – № 1…4. Каждая УБК «Луч-2» состоит из четырех кристаллизационных ячеек и механического привода с помощью которого космонавт на борту осуществляет активацию/дезактивацию процесса кристаллизации. Каждый биокристаллизатор имеет три камеры раствора белка, отделенные перекрывным клапаном от камеры раствора осадителя. Модульное выполнение корпуса каждой кристаллизационной ячейки и средства установки их в гнездах кассет позволяет в случае необходимости достаточно просто осуществить независимую замену любой ячейки или кассеты на любом этапе эксперимента без дополнительной стерилизации. Кроме того, модульное выполнение кристаллизационных ячеек, кассетный принцип их укладки позволяют реализовать процесс кристаллизации для сколь угодно широкой комбинации белковых и осаждающих растворов. На рисунке 1 представлены различные фазы выполнения на борту МКС КЭ по кристаллизации белков с использованием НА «Луч-2».

Аппаратура «Луч-2» позволяет: ­

- осуществлять визуальный контроль за ростом кристаллов; ­

- дублировать параметры среды для выращивания белковых кристаллов в каждой кассете; ­

- изменять массы и габаритов оборудования за счет изменения количества кристаллизационных кассет в укладке в зависимости от требований эксперимента и грузопотока.

Аппаратура «Луч-2» является довозимым и периодически заменяемым оборудованием для каждого нового эксперимента. Укладка «Луч-2» не требует источников электропитания и не имеет источников тепловыделения. Время занятости экипажа 2ч. 20 мин. Габариты НА 160x120x75 мм. Масса НА - 0,85 кг. Общий объём информации, оперативно передаваемый с борта МКС по каналу ОСА, составляет ~ 45 Мбайт (8 фотографий). Продолжительность выполнения эксперимента – до 3-х месяцев.

Вся предполетная подготовка (подготовительные операции, стерилизация кристаллизационных ячеек и заправка биокристаллизаторов необходимыми растворами) проводится за пять дней до старта. Все наземные транспортные операции с укладками аппаратуры «Луч-2» (доставка на Байконур, возвращение в Москву с места посадки) осуществляются с использованием наземного транспортного термостата при температуре +20 C.

В транспортный грузовой корабль УБК укладывается за 9 часов до старта. На борту РС МКС эксперимент проводится в термостатирующем контейнере «AQUA 01» или холодильнике-термостате «Криогем-03М» при температуре +20о С. При проведении эксперимента осуществлялся ежесуточный контроль температуры.

Космонавт С.Шарипов с НА «Луч-2» (МКС- 10, 2005 г.).

Размещение укладки «Луч-2» (внизу) в термостате «Криогем-03М».

Универсальные биокристаллизационные кассеты «Луч-2»

Активация процесса кристаллизации УБК аппаратуры «Луч-2».

Укладка "Луч-2" в СМ на панели 406.

Укладка "Луч-2" в раскрытом виде после доставки на МКС.

Рисунок 1 – Различные фазы выполнения КЭ с НА «Луч-2» на борту МКС.

В период с 2003 по 2008 г. УБК «Луч-2» использовалась для проведения целого ряда КЭ по кристаллизации белков – «Вакцина-К», «Гликопротеид», «Интерлейкин-К», «Миметик-К», «КАФ». С 2008 г. модернизированный вариант аппаратуры используется для проведения КЭ «Структура».

Ожидаемые результаты:

• Совершенствование технологии получения биокристаллов в условиях микрогравитации и развитие кристаллографических исследований в космосе с целью получения высококачественных белковых кристаллов.

• Полученные данные внесут существенный вклад в решение проблемы взаимосвязи структуры и функции молекулярных шаперонов, являющиеся одной из основных задач современной молекулярной биологии.

Полученные результаты:

Всего за период 2006-2008 гг. всего было проведено 3 сеанса эксперимента продолжительностью в период МКС-13 – 117 суток, МКС-16 – 51 сутки, МКС-17 – 44 суток.

В ходе реализации сеансов КЭ были получены кристаллы комплекса V-антигена и белка G. При использовании четырех различных составов осадителей (МКС-13) во всех случаях были получены кристаллы белка, максимальный размер кристаллов составил - 95?160 мкм. Один кристалл пластинчатой формы достигал размеров 400?400 мкм. Во всех случаях присутствовал аморфный осадок. Хотя полученные кристаллы в 1,5-2 раза превосходят аналогичные кристаллы, выращенные в контрольных наземных экспериментах, размер их не позволяет проводить рентгеноструктурные исследования как с использованием источника излучения ИБХ РАН, так и синхротрона.

Проведенные предварительные рентгеноструктурные исследования ряда кристаллов белка Caf1M показали их непригодность для получения набора дифракционных данных.

Основной причиной неудачи экспериментов по кристаллизации белка Caf1M и комплекса белка Caf1M c пептидом Caf1 следует считать недостаточное количество и неустойчивое качество препарата. Предварительно известные условия кристаллизации белка Caf1, определенные для метода равновесного диализа через мембрану, не воспроизводились методом диффузии через газообразное состояние. Недостаточное количество препарата не позволило произвести полномасштабный скрининг условий, а неоднозначность результатов КЭ (в силу длительности МКС-13 и жесткой посадки СА МКС-16) не позволили внести коррективы.

В результате эксперимента "КАФ" не удалось получить кристаллы белка с достоверно определяемыми гранями ни в КЭ, ни в контрольном наземном эксперименте. На заседании секции "Космическая биотехнология" от 28. 11. 2008 г. принято решение о завершении космического эксперимента "КАФ".

а) Результаты КЭ в период МКС-13. Микровидеоизображения содержимого кристаллизационных ячеек камеры 3 УБК № 8 с белком Caf 1 M (поляризованный свет). Противораствор – 50 мМ хлорид цезия, 10% Jeffamine M600 в 100 мМ MES буфере рН 6,5. Линейные размеры наибольших кристаллов составляют 95 х 150 мкм.

б) Результаты КЭ в период МКС-16. Микровидеоизображения содержимого кристаллизационных ячеек камер 1 и 3 УБК № 8 с белком Caf 1 M (поляризованный свет). Противораствор 10 мМ хлорид кобальта, 1М 1,6-гександиол в 100 мМ Na-ацетатном буфере рН 4,6. Линейные размеры наибольшего фрагмента пластинчатого кристалла составляет 400 х 400 мкм.

Рисунок 2 – Микровидеоизображения содержимого кристаллизационных ячеек с белком Caf 1 M, полученные в результаты выполнения КЭ «КАФ» в период МКС-13 (а) и МКС-16 (б).

Сроки проведения: КЭ завершен в 2008 году.
Состояние эксперимента: Завершен
Организация постановщик: ОАО «Биопрепарат»
Организации участники: Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН НПП «БиоТехСис» ОАО РКК «Энергия» им С.П.Королева ФГБУ НИИ ЦПК им. Ю.А.Гагарина
Научный руководитель: Щербаков Г. Я., ОАО «Биопрепарат», начальник Научно-технического управления, д.м.н., профессор
Публикации по эксперименту:

1. И.Н.Цыганник, И.В.Артемьев, С.Ф.Архипова, В.З.Плетнев, Г.Я. Щербаков «Кристаллизация белков в условиях микрогравитации»// В сб.: Материалы научно-технической конференции по основным результатам научно-прикладных исследований на РС МКС, г.Королев 2007г.

2. А.И. Гребенко, Н.Е Жухлистова, Ю.А Кислицын, И.П. Куранова с др. Эксперименты по кристаллизации белков на борту РС МКС, Космонавтика и ракетостроение, 4(49) 2007г. с. 13.

Последнее обновление: 15.11.2017

Информационная справка

Программы

Изображения