Выбор языка |
Главная О КНТС Новости Программы Направления исследований Эксперименты Результаты Информационные ресурсы Приём заявок
Шифр эксперимента: Интерлейкин-К
Направление НПИ: 4. Космическая биология и биотехнология
Секция КНТС: 1. Космическая биология и физиология
Наименование эксперимента: Получение высококачественных кристаллов интерлейкинов - 1 альфа, - 1Вета и рецепторного антагониста интерлейкина-1.
Цель эксперимента:

Получение кристаллов интерлейкинов (ИЛ) – 1-альфа, - 1-бета и рецепторного антагониста интерлейкина-1 в условиях космического полета с последующим рентгеноструктурным анализом кристаллов.

Описание эксперимента:

Внедрение современных подходов к созданию эффективных лекарственных препаратов требует наличия препаратов в кристаллическом виде, так как знание пространственной структуры биомолекулы в сочетании с физико-химическими данными позволят наиболее полно моделировать ее структурно-функциональные особенности. Анализ пространственной структуры дает информацию по конформации активного центра, по эффективности конструкции белка, и позволяет внести необходимые изменения для повышения биологической активности искусственных белков.

Молекула белка, будучи достаточно громоздким (в атомном смысле) образованием, удерживается в кристаллической ячейке относительно слабыми силами. Это приводит, с одной стороны, к чрезвычайно низкой механической прочности белковых кристаллов. С другой стороны, появляются значительная зависимость совершенства растущих кристаллов от конвективных потоков в объеме, где они растут, и влияние гравитационных сил на рост кристаллов. Аналитический учет этих влияний остается трудно разрешимой задачей и поэтому выращивание белковых кристаллов ведется с использованием эмпирических правил, при этом далеко не всегда удается вырастить кристалл заданного белка.

Среди методов, позволяющих улучшить качество белковых кристаллов, кристаллизация белков в условиях невесомости занимает особое место. Как показывают космические эксперименты, отсутствие гравитации и конвективных потоков позволяет получить совершенную структуру кристаллов. Кроме этого, проведение экспериментов в невесомости, когда транспорт вещества к растущему кристаллу осуществляется посредством диффузии, дает возможность развить представления о механизмах роста кристаллов белков, что важно и для наземных технологий.

К наиболее распространенным методам кристаллизации относятся паровая диффузия (метод висячей капли) и метод диализа. При диализном методе кристаллизации белковый раствор и раствор осадителя разделены полупроницаемой мембраной. Белковый раствор переходит в перенасыщенное состояние за счет диффузии через мембрану в раствор осадителя. Условия кристаллизации легко контролируются композицией состава осаждающего раствора и его рН. Паровая диффузия методом «висячей капли» заключается в том, что каплю раствора белка наносят на силиконовую подложку, затем переворачивают для получения висячей капли и помещают над резервуаром, содержащим более высокую концентрацию осадителя. При этом происходит плавное выравнивание концентраций через паровую фазу. С помощью этого метода можно быстро исследовать ряд комбинаций рН, концентраций осадителя и буферов.

Космический эксперимент «Интерлейкин-К» направлен на получение кристаллов кристаллов интерлейкинов (ИЛ) – 1-альфа, - 1-бета и рецепторного антагониста интерлейкина-1 (РАИЛ) в условиях космического полета с последующим рентгеноструктурным анализом кристаллов с целью получения данных и определения атомной структуры высокого разрешения для рационального дизайна эффективных и безопасных вакцин нового поколения, разработки новых антивирусных препаратов и диагностических систем.

Объектом исследований является генно-инженерный (рекомбинантный) белок интерлейкин 1?. Семейство молекул интерлейкина-1 включает три белка, имеющих структурную гомологию на 25%. Эти белки играют существенную роль в регуляции множества функций организма. При этом ИЛ-1a и ИЛ-1? являются агонистами, в то время как белок РАИЛ – антагонистом многих функций этих молекул. До начала КЭ был проведен предварительный анализ рецептор-связывающих доменов ИЛ-1 и РАИЛ с использованием методов кристаллизации белков, однако установления точной структуры не было достигнуто. Выяснение точной структуры позволило бы разработать новые фармакологические подходы.

Новизна эксперимента:

Научный приоритет планируемого эксперимента состоит в получении кристаллов белков семейства ИЛ-1 в условиях орбитального полета, что даст возможность более точно определить сайты взаимодействия каждой из трех молекул со специфическим рецептором ИЛ-1 первого типа. Данные, полученные в КЭ, могут быть использованы для понимания функционирования этих молекул в физиологических и паталогических условиях, что позволит подойти к целенаправленной регуляции этих важнейших медиаторных систем организма.

Научная аппаратура:

Для решения задач по выращиванию в космосе качественных кристаллов белков на основе отечественного и зарубежного опыта НПП «БиоТехСис» была разработана универсальная биокристаллизационная кассета (УБК) «Луч-2».

УБК «Луч-2» предназначена для выращивания монокристаллов биологических препаратов методом диализа через полупроницаемую мембрану или комбинированным методом диализа и диффузии через газообразное состояние. Оба реализуемых в УБК «Луч-2» метода направлены на постепенное изменение концентрации осаждающего агента в камерах с раствором биологического препарата с целью достижения условий образования его монокристаллов. Аппаратура «Луч-2» представляет собой два вкладыша Укладка № 1 и Укладка № 2. В каждой укладке уложены четыре универсальных биокристаллизационных кассеты (УБК) «Луч-2» – № 1…4. Каждая УБК «Луч-2» состоит из четырех кристаллизационных ячеек и механического привода с помощью которого космонавт на борту осуществляет активацию/дезактивацию процесса кристаллизации. Каждый биокристаллизатор имеет три камеры раствора белка, отделенные перекрывным клапаном от камеры раствора осадителя. Модульное выполнение корпуса каждой кристаллизационной ячейки и средства установки их в гнездах кассет позволяет в случае необходимости достаточно просто осуществить независимую замену любой ячейки или кассеты на любом этапе эксперимента без дополнительной стерилизации. Кроме того, модульное выполнение кристаллизационных ячеек, кассетный принцип их укладки позволяют реализовать процесс кристаллизации для сколь угодно широкой комбинации белковых и осаждающих растворов. На рисунке 1 представлены различные фазы выполнения на борту МКС КЭ по кристаллизации белков с использованием НА «Луч-2».

Аппаратура «Луч-2» позволяет: ­

- осуществлять визуальный контроль за ростом кристаллов; ­

- дублировать параметры среды для выращивания белковых кристаллов в каждой кассете; ­

- изменять массы и габаритов оборудования за счет изменения количества кристаллизационных кассет в укладке в зависимости от требований эксперимента и грузопотока.

Аппаратура «Луч-2» является довозимым и периодически заменяемым оборудованием для каждого нового эксперимента. Укладка «Луч-2» не требует источников электропитания и не имеет источников тепловыделения. Время занятости экипажа 2ч. 20 мин. Габариты НА 160x120x75 мм. Масса НА - 0,85 кг. Общий объём информации, оперативно передаваемый с борта МКС по каналу ОСА, составляет ~ 45 Мбайт (8 фотографий). Продолжительность выполнения эксперимента – до 3-х месяцев.

Вся предполетная подготовка (подготовительные операции, стерилизация кристаллизационных ячеек и заправка биокристаллизаторов необходимыми растворами) проводится за пять дней до старта. Все наземные транспортные операции с укладками аппаратуры «Луч-2» (доставка на Байконур, возвращение в Москву с места посадки) осуществляются с использованием наземного транспортного термостата при температуре +20 C.

В транспортный грузовой корабль УБК укладывается за 9 часов до старта. На борту РС МКС эксперимент проводится в термостатирующем контейнере «AQUA 01» или холодильнике-термостате «Криогем-03М» при температуре +20о С. При проведении эксперимента осуществлялся ежесуточный контроль температуры.

Космонавт С.Шарипов с НА «Луч-2» (МКС- 10, 2005 г.).

Размещение укладки «Луч-2» (внизу) в термостате «Криогем-03М».

Универсальные биокристаллизационные кассеты «Луч-2»

Активация процесса кристаллизации УБК аппаратуры «Луч-2».

Укладка "Луч-2" в СМ на панели 406.

Укладка "Луч-2" в раскрытом виде после доставки на МКС.

Рисунок 1 – Различные фазы выполнения КЭ с НА «Луч-2» на борту МКС.

В период с 2003 по 2008 г. УБК «Луч-2» использовалась для проведения целого ряда КЭ по кристаллизации белков – «Вакцина-К», «Гликопротеид», «Интерлейкин-К», «Миметик-К», «КАФ». С 2008 г. модернизированный вариант аппаратуры используется для проведения КЭ «Структура».

Ожидаемые результаты:

• Совершенствование технологии получения биокристаллов в условиях микрогравитации и развитие кристаллографических исследований в космосе с целью получения высококачественных белковых кристаллов.

• Сведения о структуре сайт-специфических регионов лигандов и рецепторов позволят предсказать структуры агонистов и антагонистов молекул ИЛ-1. Таким образом, могут быть синтезированы пептиды, несущие основные свойства белков, но не вызывающих побочных эффектов, присущих целым молекулам интерлейкинов-1.

Полученные результаты:

Всего за период 2003-2008 гг. проведено 8 сеансов КЭ во время 7, 8, 9, 10, 11, 13, 16 и 17 экспедиций. Продолжительность сеансов КЭ составляла от 39 (МКС-11) до 117 (МКС-13) суток:

- МКС-7: 59 суток (с 31.08.03 по 28.10.03)

- MКС-8: 88 суток (с 01.02.04 по 28.04.04)

- МКС-9: 90 суток (с 03.08.04 по 23.10.04)

- МКС-10: 61 сутки (с 22.02.05 по25.04.05)

- МКС-11: 39 суток (с 31.08.05 по 10.10.05)

- МКС-13:117 суток (с 17.06.06 по 10.10.06)

- МКС-16: 51 сутки (с 30.01.08 по 22.03.08)

- МКС-17: 44 суток (с 10.09.08 по 24.10.08)

В результате всех проведенных сеансов КЭ «Интерлейкин-К» в камерах с белком интерлейкин 1? в большинстве случаев было выявлено наличие мелких плоских кристаллов неправильной формы с максимальным размером около 60х150 мкм при наличии значительного в первых экспедициях (МКС-7-13) со снижением в последующих экспедициях за счет варьирования условий кристаллизации аморфного осадка (рис. 2). Полученные в КЭ кристаллы в 1,5 -2 раза превосходили аналогичные кристаллы, выращенные в контрольных наземных экспериментах, однако размер их не позволил провести рентгеноструктурные исследования как с использованием источника излучения ИБХ РАН, так и синхротрона. Проведенные предварительные рентгеноструктурные исследования ряда кристаллов белка интерлейкин - 1? показали их непригодность для получения набора дифракционных данных.

а) УБК № 2, камера 2. Противораствор 29% сульфат аммония в 50 мМ Na-фосфатном буфере (pH 7.0, 100 мМ NaCl, 0.01% NaN3). Размеры наибольших кристаллов около 60 мкм

б) УБК № 7, камера 4. Размеры наибольших кристаллов (помечены стрелками) составляют около 60х170 мкм и 60х75 мкм соответственно. В контрольном наземном эксперименте получены кристаллы в несколько раз меньших размеров.

Рисунок 2 – Микровидеоизображения содержимого кристаллизационных ячеек с белком интерлейкин 1бетта, полученные в результаты выполнения КЭ «Интерлейкин-К» в период МКС-7 (а) и МКС-17 (б).

Основной причиной неудачи экспериментов по кристаллизации белка интерлейкин-1альфа явилось неустойчивое качество препарата. Известные к началу КЭ условия кристаллизации белка интерлейкин-1бетта, определенные для метода равновесного диализа через мембрану, не удалось воспроизвести методом диффузии через газообразное состояние в космосе.

Сроки проведения: КЭ завершен в 2008 году.
Состояние эксперимента: Завершен
Организация постановщик: ОАО «Биопрепарат»
Организации участники: Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН НПП «БиоТехСис» ОАО РКК «Энергия» им С.П.Королева ФГБУ НИИ ЦПК им. Ю.А.Гагарина
Научный руководитель: Щербаков Г. Я., ОАО «Биопрепарат», д.м.н, профессор
Публикации по эксперименту:

И.Н.Цыганник, И.В.Артемьев, С.Ф.Архипова, В.З.Плетнев, Г.Я. Щербаков «Кристаллизация белков в условиях микрогравитации»// В сб.: Материалы научно-технической конференции по основным результатам научно-прикладных исследований на РС МКС, г.Королев 2007г.

Последнее обновление: 15.11.2017

Информационная справка

Программы

Изображения