Выбор языка |
Главная О КНТС Новости Программы Направления исследований Эксперименты Результаты Информационные ресурсы Приём заявок
Шифр эксперимента: Гликопротеид
Направление НПИ: 4. Космическая биология и биотехнология
Секция КНТС: 1. Космическая биология и физиология
Наименование эксперимента: Выделение и исследование поверхностных гликопротеинов Е1-Е2 альфавирусов в условиях Земли и космоса.
Цель эксперимента:

Получение данных об атомарной структуре биомолекул гликопротеинов максимально высокого разрешения для рационального конструирования эффективных и безопасных вакцин нового поколения, разработки новых антивирусных препаратов и диагностических систем.

Описание эксперимента:

Внедрение современных подходов к созданию эффективных лекарственных препаратов требует наличия препаратов в кристаллическом виде, так как знание пространственной структуры биомолекулы в сочетании с физико-химическими данными позволят наиболее полно моделировать ее структурно-функциональные особенности. Анализ пространственной структуры дает информацию по конформации активного центра, по эффективности конструкции белка, и позволяет внести необходимые изменения для повышения биологической активности искусственных белков.

Молекула белка, будучи достаточно громоздким (в атомном смысле) образованием, удерживается в кристаллической ячейке относительно слабыми силами. Это приводит, с одной стороны, к чрезвычайно низкой механической прочности белковых кристаллов. С другой стороны, появляются значительная зависимость совершенства растущих кристаллов от конвективных потоков в объеме, где они растут, и влияние гравитационных сил на рост кристаллов. Аналитический учет этих влияний остается трудно разрешимой задачей и поэтому выращивание белковых кристаллов ведется с использованием эмпирических правил, при этом далеко не всегда удается вырастить кристалл заданного белка.

Среди методов, позволяющих улучшить качество белковых кристаллов, кристаллизация белков в условиях невесомости занимает особое место. Как показывают космические эксперименты, отсутствие гравитации и конвективных потоков позволяет получить совершенную структуру кристаллов. Кроме этого, проведение экспериментов в невесомости, когда транспорт вещества к растущему кристаллу осуществляется посредством диффузии, дает возможность развить представления о механизмах роста кристаллов белков, что важно и для наземных технологий.

К наиболее распространенным методам кристаллизации относятся паровая диффузия (метод висячей капли) и метод диализа. При диализном методе кристаллизации белковый раствор и раствор осадителя разделены полупроницаемой мембраной. Белковый раствор переходит в перенасыщенное состояние за счет диффузии через мембрану в раствор осадителя. Условия кристаллизации легко контролируются композицией состава осаждающего раствора и его рН. Паровая диффузия методом «висячей капли» заключается в том, что каплю раствора белка наносят на силиконовую подложку, затем переворачивают для получения висячей капли и помещают над резервуаром, содержащим более высокую концентрацию осадителя. При этом происходит плавное выравнивание концентраций через паровую фазу. С помощью этого метода можно быстро исследовать ряд комбинаций рН, концентраций осадителя и буферов.

Космический эксперимент «Гликопротеид-К» направлен на получение кристаллов гликопротеинов Е1-Е2 альфавирусов в условиях микрогравитации с целью получения данных и определения атомной структуры высокого разрешения для рационального дизайна эффективных и безопасных вакцин нового поколения, разработки новых антивирусных препаратов и диагностических систем.

Вирус лихорадки Западного Нила относится к семейству флавовирусов (арбовирусов), включающему в себя около 80 видов вирусов, большинство из которых передается насекомыми, способны паразитировать на широком спектре млекопитающих, птиц и насекомых. Многие флавовирусы вызывают тяжелые заболевания у человека. Для России типичными представителями этого вирусного семейства являются вирусы клещевого энцефалита и лихорадки Западного Нила. Вирион флавовирусов состоит из сферического рибонуклеокапсида, окруженного липопротеидной мембраной. Геном представлен РНК, состоящей примерно из 11 тыс. оснований, кодирующих полипротеин, который подвергается посттрансляционной модификации с образованием 10 белков вируса.

Новизна эксперимента:

Исследования относятся к области молекулярной вирусологии и создания новых вакцин против опасных вирусных заболеваний. Новизна и актуальность разработки связана с принципиальной ролью гликопротеинов Е1 и Е2 в развитии инфекционного процесса и формировании иммунного ответа на альфавирусную инфекцию, распространенностью альфавирусных инфекций среди домашних животных и человека, структурными особенностями вирусных белков, которые, как правило, характерны для целой группы вирусов и обычно резко отличаются от других известных нам белков. Кристаллизация гликопротеинов Е1 и Е2 альфавирусов на Земле и в космосе еще не проводилась.

Научная аппаратура:

Для решения задач по выращиванию в космосе качественных кристаллов белков на основе отечественного и зарубежного опыта НПП «БиоТехСис» была разработана универсальная биокристаллизационная кассета (УБК) «Луч-2».

УБК «Луч-2» предназначена для выращивания монокристаллов биологических препаратов методом диализа через полупроницаемую мембрану или комбинированным методом диализа и диффузии через газообразное состояние. Оба реализуемых в УБК «Луч-2» метода направлены на постепенное изменение концентрации осаждающего агента в камерах с раствором биологического препарата с целью достижения условий образования его монокристаллов. Аппаратура «Луч-2» представляет собой два вкладыша Укладка № 1 и Укладка № 2. В каждой укладке уложены четыре универсальных биокристаллизационных кассеты (УБК) «Луч-2» – № 1…4. Каждая УБК «Луч-2» состоит из четырех кристаллизационных ячеек и механического привода с помощью которого космонавт на борту осуществляет активацию/дезактивацию процесса кристаллизации. Каждый биокристаллизатор имеет три камеры раствора белка, отделенные перекрывным клапаном от камеры раствора осадителя. Модульное выполнение корпуса каждой кристаллизационной ячейки и средства установки их в гнездах кассет позволяет в случае необходимости достаточно просто осуществить независимую замену любой ячейки или кассеты на любом этапе эксперимента без дополнительной стерилизации. Кроме того, модульное выполнение кристаллизационных ячеек, кассетный принцип их укладки позволяют реализовать процесс кристаллизации для сколь угодно широкой комбинации белковых и осаждающих растворов. На рисунке 1 представлены различные фазы выполнения на борту МКС КЭ по кристаллизации белков с использованием НА «Луч-2».

Аппаратура «Луч-2» позволяет: ­

- осуществлять визуальный контроль за ростом кристаллов; ­

- дублировать параметры среды для выращивания белковых кристаллов в каждой кассете; ­

- изменять массы и габаритов оборудования за счет изменения количества кристаллизационных кассет в укладке в зависимости от требований эксперимента и грузопотока.

Аппаратура «Луч-2» является довозимым и периодически заменяемым оборудованием для каждого нового эксперимента. Укладка «Луч-2» не требует источников электропитания и не имеет источников тепловыделения. Время занятости экипажа 2ч. 20 мин. Габариты НА 160x120x75 мм. Масса НА - 0,85 кг. Общий объём информации, оперативно передаваемый с борта МКС по каналу ОСА, составляет ~ 45 Мбайт (8 фотографий). Продолжительность выполнения эксперимента – до 3-х месяцев.

Вся предполетная подготовка (подготовительные операции, стерилизация кристаллизационных ячеек и заправка биокристаллизаторов необходимыми растворами) проводится за пять дней до старта. Все наземные транспортные операции с укладками аппаратуры «Луч-2» (доставка на Байконур, возвращение в Москву с места посадки) осуществляются с использованием наземного транспортного термостата при температуре +20 C.

В транспортный грузовой корабль УБК укладывается за 9 часов до старта. На борту РС МКС эксперимент проводится в термостатирующем контейнере «AQUA 01» или холодильнике-термостате «Криогем-03М» при температуре +20о С. При проведении эксперимента осуществлялся ежесуточный контроль температуры.

Космонавт С.Шарипов с НА «Луч-2» (МКС- 10, 2005 г.).

Размещение укладки «Луч-2» (внизу) в термостате «Криогем-03М».

Универсальные биокристаллизационные кассеты «Луч-2»

Активация процесса кристаллизации УБК аппаратуры «Луч-2».

Укладка "Луч-2" в СМ на панели 406.

Укладка "Луч-2" в раскрытом виде после доставки на МКС.

Рисунок 1 – Различные фазы выполнения КЭ с НА «Луч-2» на борту МКС.

В период с 2003 по 2008 г. УБК «Луч-2» использовалась для проведения целого ряда КЭ по кристаллизации белков – «Вакцина-К», «Гликопротеид», «Интерлейкин-К», «Миметик-К», «КАФ». С 2008 г. модернизированный вариант аппаратуры используется для проведения КЭ «Структура».

Ожидаемые результаты:

• Совершенствование технологии получения биокристаллов в условиях микрогравитации и развитие кристаллографических исследований в космосе с целью получения высококачественных белковых кристаллов.

• Экспериментальные данные о пространственной организации гликопротеинов Е1-Е2, полученные при исследовании кристаллов, будут использованы для изучения факторов защиты против альфавирусных инфекций; изучения особенностей иммунного ответа организма; конструирования нового поколения вакцин против этих опасных вирусных инфекций; поиска и конструирования новых антивирусных препаратов; проверки наших представлений о факторах, определяющих взаимосвязь первичной и пространственной структуры этих вирусных белков; для рационального дизайна эффективных и безопасных вакцин нового поколения, разработки антивирусных препаратов и диагностических систем.

Полученные результаты:

Объектом исследований является рекомбинантный фрагмент белка Е вируса лихорадки Западного Нила (ВЗН).

Фрагмент белка Е ВЗН был получен из штамма Vlg27889LEIV, который был выделен в 1999 году в период вспышки в Волгограде. Ген был клонирован в плазмиду, которая экспрессирует фрагмент белка (с 240 по 466 аминокислотный остаток). Полученной конструкцией трансформировали E.coli JM103. Проведена оптимизация условий экспрессии фрагмента белка Е, его аффинная очистка и иммунологическая характеристика.

В наземных экспериментах было показано, что рекомбинантный фрагмент белка Е сохраняет способность взаимодействовать с 4 типами нейтрализующих моноклональных антител к белку Е ВЗН. Этот факт свидетельствовал о том, что антигенная структура рекомбинантного белка Е сохранена и рентгеноструктурное исследование кристаллов этого белка позволит получить приоритетные результаты по пространственной структуре основных нейтрализующих эпитопов ВЗН для конструирования новых антивирусных препаратов и разработки диагностических средств.

Всего в период 2005-2008 гг. проведено 4 серии экспериментов (в ТЗ на КЭ определено 10 сеансов КЭ как минимально необходимое) во время 11-ой, 13-ой,16-ой и 17-ой экспедиций. Продолжительность сеансов КЭ составляла от 5,6 до 16,7 недель (в ТЗ было обозначено 9 недель с уточнением на стадии наземной отработки):

- в период МКС-11: 39 суток (с 31.08.05 по 10.10.05);

- в период МКС-13:117 суток (с 17.06.06 по 10.10.06);

- в период МКС-16: 51 сутки (с 30.01.08 по 22.03.08);

- в период МКС-17: 44 суток (с 10.09.08 по 24.10.08).

В эксперименте использовалась укладка "Луч-2", состоящая из четырех универсальных биокристаллизационных кассет, каждая из которых включает в себя четыре кристаллизационные ячейки и механический привод. Каждая ячейка имеет три белковых камеры. После доставки научного оборудования на РС МКС с помощью механического привода космонавт запускает процесс кристаллизации белков и по окончании эксперимента прекращает его. Одновременно в укладке "Луч-2" проводились также КЭ "Миметик-К", "Вакцина-К", "КАФ" и "Интерлейкин-К" (см. также раздел КЭ «Вакцина-К»).

В результате КЭ «Гликопротеид-К» в большинстве случаев было выявлено наличие мелких кристаллов призматической формы с максимальным размером около 100 мкм при наличии аморфного осадка (рис.1).

Обычное освещение

Поляризованный свет

Результаты КЭ в период МКС-9. Микровидеоизображения содержимого кристаллизационных ячеек с белком TBI (УБК № 5, кам. 4). Противораствор- 10% ПЭГ 8000 и 65 мМ (NH4)2SO4 в 35 мМ Na-какодилатном буфере. Размеры наибольших кристаллов составляют 90 х 30 х 20 мкм.

Результаты КЭ в период МКС-13. Микровидеоизображения содержимого кристаллизационных ячеек камеры 3 УБК № 5 с белком «Гликопротеид-К». Линейные размеры наибольших кристаллов не превышают 20-25 мкм.

Результаты КЭ в период МКС-15. Микровидеоизображения содержимого кристаллизационных ячеек камер 3 и 4 УБК № 5 с белком «Гликопротеид». Линейные размеры наибольших кристаллических образований составляют около 100х60 мкм.

Результаты КЭ в период МКС-17. а) Микровидеоизображение содержимого кристаллизационных ячеек камер 3 и 4 УБК № 5 с белком «Гликопротеид». Линейные размеры наибольших кристаллических образований составляют около 60х30 мкм (помечены стрелкой). б) Контрольный наземный эксперимент. Размеры наибольших кристаллов - ~20х30 мкм.

Рисунок 2 – Результаты КЭ «Гликопротеид-К» в период МКС-13, МКС-15, МКС-17.

Во время 13 экспедиции длительность эксперимента составила более 16-ти недель, большинство ячеек белковых камер оказалось полностью сухими, в связи с чем кристаллы белка были обнаружены на стенках и мембранах камер. Хотя полученные кристаллы в 1,5-2 раза превосходили аналогичные кристаллы, выращенные в контрольных наземных экспериментах, размеры их не позволили провести рентгеноструктурные исследования как с использованием источника излучения ИБХ РАН, так и синхротрона.

Основной причиной неудачи экспериментов по кристаллизации белка гликопротеина постановщики КЭ считают неустойчивое качество препарата. Рефолдинг (ренатурация) белка часто сопровождался неконтролируемой агрегацией, что явилось причиной существенного снижения содержания белка в растворе. Поскольку для рекомбинантного фрагмент белка Е вируса лихорадки Западного Нила условия образования кристаллов к началу КЭ известны не были, по всей видимости, объем проведенных наземных экспериментальных исследований в рамках КЭ оказался недостаточным, что не позволило подобрать условиях для получения кристаллов ни на Земле, ни в космосе.

Таким образом, в результате проведенных летных экспериментов не удалось получить кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного анализа, задачи КЭ не были решены. На заседании секции «Космическая биотехнология» от 28.11.2008 г. принято решение о завершении космического эксперимента «Гликопротеид-К».

Сроки проведения: КЭ завершен в 2008 году.
Состояние эксперимента: Завершен
Организация постановщик: ОАО «Биопрепарат»
Организации участники: Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН НПП «БиоТехСис» ОАО РКК «Энергия» им С.П.Королева ФГБУ НИИ ЦПК им. Ю.А.Гагарина
Научный руководитель: Щербаков Г.Я., ОАО «Биопрепарат», д.м.н., профессор
Публикации по эксперименту:

И.Н.Цыганник, И.В.Артемьев, С.Ф.Архипова, В.З.Плетнев, Г.Я. Щербаков «Кристаллизация белков в условиях микрогравитации»// В сб.: Материалы научно-технической конференции по основным результатам научно-прикладных исследований на РС МКС, г.Королев 2007г.

Последнее обновление: 15.11.2017

Информационная справка

Программы

Изображения