Внедрение современных подходов к созданию эффективных лекарственных препаратов требует наличия препаратов в кристаллическом виде, так, как знание пространственной структуры биомолекулы в сочетании с физико-химическими данными позволят наиболее полно моделировать ее структурно-функциональные особенности. Анализ пространственной структуры дает информацию по конформации активного центра, по эффективности конструкции белка, и позволяет внести необходимые изменения для повышения биологической активности искусственных белков.

Молекула белка, будучи достаточно громоздким (в атомном смысле) образованием, удерживается в кристаллической ячейке относительно слабыми силами. Это приводит, с одной стороны, к чрезвычайно низкой механической прочности белковых кристаллов. С другой стороны, появляются значительная зависимость совершенства растущих кристаллов от конвективных потоков в объеме, где они растут, и влияние гравитационных сил на рост кристаллов. Аналитический учет этих влияний остается трудно разрешимой задачей и поэтому выращивание белковых кристаллов ведется с использованием эмпирических правил, при этом далеко не всегда удается вырастить кристалл заданного белка.

Космический эксперимент «Вакцина-К» посвящен исследованию физических процессов кристаллизации рекомбинантного искусственного белка TBI, содержащего 4 Т- и 5 I- клеточных нейтрализующих эпитопов вируса иммунодефицита человека 1 (T- and B-cell epitipe containing Immunogen).

К наиболее распространенным методам кристаллизации относятся паровая диффузия (метод висячей капли) и метод диализа. При диализном методе кристаллизации белковый раствор и раствор осадителя разделены полупроницаемой мембраной. Белковый раствор переходит в перенасыщенное состояние за счет диффузии через мембрану в раствор осадителя. Условия кристаллизации легко контролируются композицией состава осаждающего раствора и его рН. Паровая диффузия методом «висячей капли» заключается в том, что каплю раствора белка наносят на силиконовую подложку, затем переворачивают для получения висячей капли и помещают над резервуаром, содержащим более высокую концентрацию осадителя. При этом происходит плавное выравнивание концентраций через паровую фазу. С помощью этого метода можно быстро исследовать ряд комбинаций рН, концентраций осадителя и буферов.

Для решения задач по выращиванию в космосе качественных кристаллов белков на основе отечественного и зарубежного опыта НПП «БиоТехСис» была разработана универсальная биокристаллизационная кассета (УБК) «Луч-2».

УБК «Луч-2» предназначена для выращивания монокристаллов биологических препаратов методом диализа через полупроницаемую мембрану или комбинированным методом диализа и диффузии через газообразное состояние. Оба реализуемых в УБК «Луч-2» метода направлены на постепенное изменение концентрации осаждающего агента в камерах с раствором биологического препарата с целью достижения условий образования его монокристаллов. Аппаратура «Луч-2» представляет собой два вкладыша Укладка № 1 и Укладка № 2. В каждой укладке уложены четыре универсальных биокристаллизационных кассеты (УБК) «Луч-2» – № 1…4. Каждая УБК «Луч-2» состоит из четырех кристаллизационных ячеек и механического привода с помощью которого космонавт на борту осуществляет активацию/дезактивацию процесса кристаллизации. Каждый биокристаллизатор имеет три камеры раствора белка, отделенные перекрывным клапаном от камеры раствора осадителя. Модульное выполнение корпуса каждой кристаллизационной ячейки и средства установки их в гнездах кассет позволяет в случае необходимости достаточно просто осуществить независимую замену любой ячейки или кассеты на любом этапе эксперимента без дополнительной стерилизации. Кроме того, модульное выполнение кристаллизационных ячеек, кассетный принцип их укладки позволяют реализовать процесс кристаллизации для сколь угодно широкой комбинации белковых и осаждающих растворов. На рисунке 1 представлены различные фазы выполнения на борту МКС КЭ по кристаллизации белков с использованием НА «Луч-2».

Аппаратура «Луч-2» позволяет: ­

- осуществлять визуальный контроль за ростом кристаллов; ­

- дублировать параметры среды для выращивания белковых кристаллов в каждой кассете; ­

- изменять массы и габаритов оборудования за счет изменения количества кристаллизационных кассет в укладке в зависимости от требований эксперимента и грузопотока.

Аппаратура «Луч-2» является довозимым и периодически заменяемым оборудованием для каждого нового эксперимента. Укладка «Луч-2» не требует источников электропитания и не имеет источников тепловыделения. Время занятости экипажа 2ч. 20 мин. Габариты НА 160x120x75 мм. Масса НА - 0,85 кг. Общий объём информации, оперативно передаваемый с борта МКС по каналу ОСА, составляет ~ 45 Мбайт (8 фотографий). Продолжительность выполнения эксперимента – до 3-х месяцев.

Вся предполетная подготовка (подготовительные операции, стерилизация кристаллизационных ячеек и заправка биокристаллизаторов необходимыми растворами) проводится за пять дней до старта. Все наземные транспортные операции с укладками аппаратуры «Луч-2» (доставка на Байконур, возвращение в Москву с места посадки) осуществляются с использованием наземного транспортного термостата при температуре +20 C.

В транспортный грузовой корабль УБК укладывается за 9 часов до старта. На борту РС МКС эксперимент проводится в термостатирующем контейнере «AQUA 01» или холодильнике-термостате «Криогем-03М» при температуре +20о С. При проведении эксперимента осуществлялся ежесуточный контроль температуры.

Рисунок 1 – Различные фазы выполнения КЭ с НА «Луч-2» на борту МКС.

В период с 2003 по 2008 г. УБК «Луч-2» использовалась для проведения целого ряда КЭ по кристаллизации белков – «Вакцина-К», «Гликопротеид», «Интерлейкин-К», «Миметик-К», «КАФ». С 2008 г. модернизированный вариант аппаратуры используется для проведения КЭ «Структура».

• Получение белковых кристаллов экспериментальной вакцины против СПИД'а на основе белка TBI.

• Совершенствование технологии получения биокристаллов в условиях микрогравитации и развитие кристаллографических исследований в космосе с целью получения высококачественных белковых кристаллов.

• Экспериментальные данные, полученные при исследовании кристаллов вакцины против СПИДа, будут использованы для ее совершенствования. Это позволит получить усовершенствованный вакцинный препарат против данного крайне опасного вирусного заболевания.

В период 2004- 2008г (МКС-9 – МКС-17) проведены 6 сеансов эксперимента КЭ «Вакцина-К».

Реализация каждого сеанса КЭ по кристаллизации осуществляется в несколько этапов:

- предполетная подготовка биокристаллизатора (регламентные работы);

- предполетная подготовка препаратов (белки и наборов реактивов);

- подбор условий кристаллизации с использованием стандартных наборов реактивов;

- подбор условий кристаллизации в рабочей аппаратуре;

- заправка биокристаллизационных кассет; проведение сеанса эксперимента на орбите; предварительная оценка качества выросших кристаллов и отбор качественных кристаллов для дальнейшей работы.

Подбор условий кристаллизации в КЭ «Вакцина-К» проводился в соответствии со стандартными методиками, а также методиками, разработанными в ИБХ РАН.

Источником получения рекомбинантного белка TBI являлся штамм E.coli JM103, несущий плазмиду рTBI с синтетическим геном, кодирующим белок TBI. Степень очистки препарата, используемого для кристаллизации составил около 95 % (данные SDS-электрофореза).

В результате проведения сеансов КЭ «Вакцина-К» в большинстве случаев было выявлено наличие кристаллов стержнеобразной, трубчатой формы или без определенной огранки с максимальным размером около 200 мкм при наличии аморфного осадка (рис. 2). Однако, несмотря на то, что полученные кристаллы в 1,5-2 раза превосходили аналогичные кристаллы, выращенные в контрольных наземных экспериментах, размер их не позволил провести рентгеноструктурные исследования как с использованием источника излучения ИБХ РАН (рис. 3), так и использованного типа синхротрона.

Результаты КЭ в период МКС-9. Микровидеоизображения содержимого кристаллизационных ячеек с белком TBI (УБК № 5, кам. 4). Противораствор- 10% ПЭГ 8000 и 65 мМ (NH4)2SO4 в 35 мМ Na-какодилатном буфере. Размеры наибольших кристаллов составляют 90 х 30 х 20 мкм.

Результаты КЭ в период МКС-9. Микровидеоизображения содержимого кристаллизационных ячеек с белком TBI (УБК № 8, кам. 4). Противораствор- 9% хлорид натрия. Размеры наибольших кристаллов составляют 100 х 30 х 20 мкм.

Результаты контрольного наземного эксперимента в период МКС-9. Микровидеоизображения содержимого кристаллизационных ячеек с белком TBI (УБК № 15, кам. 1). Противораствор- 9% хлорид натрия Размеры наибольших кристаллов не превышают 30 мкм.

Рисунок 2 – Результаты КЭ «Вакцина-К» в период МКС-9.

Проведенные предварительные рентгеноструктурные исследования наиболее крупных кристаллов белка TBI («Вакцина-К») показали их непригодность для получения набора дифракционных данных.

Рисунок 3 - Микровидеоизображение рентгеновского капилляра с вмонтированным в него кристаллом.

В результате выполнения эксперимента «Вакцина-К» не удалось получить кристаллов белка с достоверно определяемыми гранями ни в КЭ, ни в контрольном наземном эксперименте, на основании чего было принято решение о завершении космического эксперимента «Вакцина-К».

Список публикаций в процессе редактирования.