Выбор языка |
Главная О КНТС Новости Программы Направления исследований Эксперименты Результаты Информационные ресурсы Приём заявок
Шифр эксперимента: Антиген
Направление НПИ: 4. Космическая биология и биотехнология
Секция КНТС: 1. Космическая биология и физиология
Наименование эксперимента: Оптимизация гетерологической экспрессии в дрожжах-сахаромицетах в условиях микрогравитации на примере синтеза HBS антигена вируса гепатита В
Цель эксперимента:

Сравнительное изучение специфики гетерологической экспрессии гена HBsAg вируса гепатита В в дрожжах S.cerevisiae в условиях микрогравитации и земного притяжения и установление приемов оптимизации синтеза.

Описание эксперимента:

Использование дрожжей-сахаромицетов в качестве продуцентов разнообразных биологически активных веществ имеет большое распространение в современной биотехнологии, так как они объединяют в себе ряд ценных технологических свойств – простота и экономичность культивирования, отсутствие эндотоксинов, наличие адекватного клеточного процессинга синтезируемых продуктов. Последнее обстоятельство в большой степени определило успех применения дрожжей в качестве продуцентов генно-инженерных гетерологичных белков. В настоящее время созданы разнообразные дрожжевые рекомбинантные вакцины и диагностикумы, многие из которых успешно применяются в клинике для профилактики, лечения и диагностики различных заболеваний. Примером успешной разработки генно-инженерного препарата на основе клеток дрожжей-сахаромицетов является конструирование рекомбинантной вакцины против вируса гепатита B, эффективность и безопасность которой доказана многими исследованиями.

Разрабатываемая в СПбНИИВС технология получения рекомбинантной вакцины гепатита B основана на использовании в качестве продуцентов трансформированных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae,

Процесс культивирования продуцентов в промышленных и полупромышленных условиях является двустадийным и не оптимален, поскольку занимает значительное время и требует ряда малоэффективных и трудоемких операций. Одним из возможных путей оптимизации процесса является создание условий для повышения стабильности и продуктивности работы участка генома, контролирующего выработку HBs-антигена вируса гепатита B. Этого можно достичь, варьируя различные факторы окружающей среды, как биотические, так и абиотические. В качестве таких факторов предлагается использовать условия космического полета на борту космических кораблей.

В ходе отдельных сеансов космического эксперимента «Антиген» проводились исследования по культивированию дрожжей-сахаромицетов до и после экспонирования на МКС в условиях воздействия факторов космического полета (микрогравитации, радиации, вибрации, перепадов температуры), выделению и определению активности HBs-антигена, оценке его митотической стабильности, определению уровня гетерогенности популяций. Использовали микробиологические и биохимические методы.

В эксперименте решались следующие задачи: ­

- создание коллекции клонов штамма-продуцента с наследуемыми отклонениями в уровне экспрессии гена HBsAg; ­

- проведение генетического анализа и рестрикционного картирования плазмид в мутантных клонах; ­

- определение экспрессирующей активности и параметров культивирования в наземных условиях; ­

- представление схемы экспериментов по анализу синтеза HBsAg в условиях микрогравитации и обработка данных.

Новизна эксперимента:

Проводимые исследования по сравнительному анализу специфики генноинженерного анализа синтеза рекомбинантного HbsAg вируса гепатита В дрожжах как в земных условиях, так и в условиях микрогравитации являются оригинальными и не имеют аналогов. Новизна экспериментов заключается не только в выборе объекта исследования, но и в постановке конкретных задач КЭ, а именно, определить влияние факторов космического полета на все этапы гетерологической экспрессии HbsAg и стадии промышленного культивирования продуцентов.

Научная аппаратура:

Для проведения космического эксперимента использовалась аппаратура (укладка) «Биоэкология. Укладка «Биоэкология» (рис. 1) включает в себя 4 пенала (рис. 2), предназначенных для транспортировки, экспонирования и хранения биообъектов. Каждый из четырех пеналов «Биоэкология» представляется собой контейнер, размещенный в чехле. В каждом пенале размещается: ­

- двенадцать пробирок, в каждой пробирке находится по 1 ампуле с лиофильно высушенным материалом; ­

- 4 тубы, в каждой тубе находится 1 пробирка с биообъектами на питательной среде. ­

- регистратор температуры (РТ).

Пробирки и тубы герметичны.

В сеансах КЭ «Антиген» в пробирках находились лиофилизированные клетки, тубы содержали культуры дрожжевых клеток либо на плотном агаре, либо в жидкой питательной среде. Время экспонирования пеналов на борту было различным и составило за весь период проведения КЭ от 7 дней до 21 месяца.

Рисунок 1- Укладка «Биоэкология» КЭ «Антиген» на борту РС МКС.

Рисунок 2 - Пенал «Биоэкология»

Ожидаемые результаты:

Проведение эксперимента позволит получить максимально полную характеристику потенциала гетерологической экспрессии гена HbsAg в дрожжах сахаромицетах, как для отдельных внутриклеточных этапов синтеза, так и стадии промышленного культивирования. В итоге, будут сформулированы принципы повышения продуктивности штаммов-продуцентов, стабильности их экспрессии и оптимизации производства вакцины против гепатита В.

Полученные результаты:

С 2006 г. проведено 8 летных экспериментов КЭ «Антиген» - в период экспедиций МКС-13 – МКС-18. На РС МКС доставлялось от 1 до 4-х пеналов «Биоэкология» с биообразцами, которые экспонировались в соответствии с различными температурно-временными циклограммами. Во время выполнения КЭ пеналы «Биоэкология», крепились к панелям модулей РС МКС (рис.1). Пеналы на борт МКС доставлялись транспортными кораблями.

Объектом исследований в КЭ были клоны промышленного рекомбинантного штамма Y-1678 дрожжей S.cerevisiae – продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Предварительно в ФГУП СПбНИИ вакцин и сывороток ФМБА была получена коллекция клонов штамма-продуцента с измененным уровнем синтеза HBsAg, проведен анализ параметров культивирования продуцента и выделены клоны, представляющие интерес для дальнейших исследований в наземных и космических условиях. Штаммы представляли собой клоны промышленного рекомбинантного штамма Y-1678: диплоидные клетки, гетерозиготные по типу спаривания, трансформированные плазмидой pSc 3954, в составе которой клонированы гены HBsAg и ?-лактамазы Е. coli. Отличия между штаммами заключались в разном наборе мутаций в гетерозиготном состоянии и различном уровне экспрессии HBsAg. Для космического эксперимента клетки штаммов были представлены в трёх вариантах: лиофильно высушенные, посеянные на плотную среду YEPD и внесённые в жидкую среду YEPD.

Анализ летных и наземных серий штаммов проводился по следующим параметрам:

1) морфологическая характеристика клеток;

2) уровень накопления биомассы при росте в жидкой среде;

3) уровень синтеза вирусного антигена;

4) Показатели митотической стабильности экспрессирующего вектора по признаку сохранения LEU+-фенотипа;

5) уровень гетерогенности популяции клонов штамма по признаку количества синтезируемых гетерологичных белков HBs-антигена и ?-лактамазы Escherichia coli.

Оценка влияния факторов космического полёта на биотехнологические характеристики дрожжей-сахаромицетов, продуцентов HBs-антигена вируса гепатита B позволила выявить следующую общую тенденцию: наибольшее влияние оказывают факторы культивирования, начального состояния материала, другие факторы, не связанные с космическими условиями. Разброс данных в пределах одной серии эксперимента меньше, чем разброс данных в пределах разных серий эксперимента, разных штаммов, даже если сроки пребывания материала в космосе в разных сериях были одинаковы. Этот вывод рассматривается постановщиком КЭ как положительный. Полученные результаты показывают возможность адекватного существования микроорганизмов на борту космических кораблей в составе «биотехнологических фабрик», что представляет интерес для осуществления межпланетных длительных полётов. Космические эксперименты продемонстрировали, что отбор культур микроорганизмов с нужными свойствами можно вести и на Земле, и в космосе. Основная работа всё же пока ведётся на Земле.

В результате проведенных исследований и сравнительного анализа результатов космического и наземного контрольного экспериментов «Антиген» сделано заключение, что выживаемость дрожжевых клеток после пребывания в условиях невесомости в жидких культурах падает, также как и в наземных контрольных вариантах.

Показано, что условия микрогравитации являются вполне адекватными для функционирования живых микроорганизмов и могут служить дополнительным фактором отбора для селекционной работы. Лиофильно высушенные штаммы проявляют стабильность и устойчивость к стрессовым воздействиям космического полета по признаку накопления биомассы в жидкой среде после оживления культур и нескольких пассажей: уровень накопления биомассы не отличается у наземных и летных вариантов.

В случае лётных серий штаммов S. cerevisiae D24 и S. cerevisiae D25 происходит статистически достоверное увеличение числа клонов фенотипических групп с крайними показателями уровня экспрессии. Увеличение степени гетерогенности при сохранении типов фенотипических групп свидетельствует о наличии факторов в условиях космического полёта, усиливающих генетическую нестабильность генно-инженерного синтеза. Данное явление имеет положительную сторону, так как в популяции растёт число клонов с увеличением продукции вирусного белка, которые могут рассматриваться как перспективные суперпродуценты в промышленных масштабах.

В КЭ отмечается сохранение высокого уровня митотической стабильности в случае штаммов S. cerevisiae D26 и S. cerevisiae D27.

Степень гетерогенности популяции клеток дрожжевого продуцента по уровню синтеза HBsAg является, с одной стороны, его стабильным признаком, а с другой – может служить основой селекции суперпродуцентов. Условия микрогравитации могут влиять на показатели гетерогенности популяции продуцентов, что может служить важной предпосылкой отбора суперпродуцентов.

Обобщение многолетних исследований позволило постановщику КЭ сделать следующие выводы.

1. Нахождение на борту космического корабля дрожжей сахаромицетов в жидкой среде и на поверхности плотного агара не является оптимальным. Тем не менее, лётные образцы штаммов Saccharomyces cerevisiae могут быть взяты для дальнейшего анализа. Лиофильно высушенные штаммы проявляют стабильность и устойчивость к стрессовым воздействиям космического полета по этому признаку сохранения жизнеспособности.

2. Морфология клеток зависит от жизнеспособности жидких культур, а регидратированные культуры лётных и наземных образцов на уровне светового микроскопа явных отличий не имеют.

3. Уровень накопления биомассы разными штаммами S. cerevisiae при росте в жидкой среде после пребывания в условиях космического полёта в лиофильно высушенном состоянии снижается на 1–3 порядка в зависимости от штамма и, главным образом, сроков полёта. Это может иметь двоякое значение. С одной стороны, если уменьшается максимальный урожай клеток при сохранении значений титра антигена, это облегчает процесс очистки антигена. С другой стороны, при снижении уровня накопления биомассы и одновременном снижении титра антигена процесс становится экономически не выгодным.

4. Стабильность антигенных характеристик HBs-антигена не зависит от времени хранения на Земле и в условиях полета и определяется главным образом свойствами штамма. В некоторых случаях длительное, более 6 месяцев, пребывание в условиях космического полёта снижает антигенные характеристики штаммов S. cerevisiae.

5. Полученные в земных условиях данные по оптимизации параметров культивирования некоторых штаммов-продуцентов сохраняют свою актуальность и для летных серий штаммов: в модифицированной среде HPi' уменьшается максимальный урожай клеток при сохранении значений титра антигена, что облегчает процесс очистки антигена.

6. При длительных полётах более 6 месяцев снижается митотическая стабильность экспрессирующего вектора по признаку сохранения LEU+-фенотипа штаммов S. cerevisiae. В то же время сохраняется тенденция более высокого уровня стабильности в случае штаммов S. cerevisiae D26 и S. cerevisiae D27.

7. По уровню синтеза вирусного антигена выявлены три фенотипические группы: со среднестатистическими показателями экспрессии, с превышением уровня экспрессии на 2 титра и с уменьшением уровня экспрессии на 2 титра. С этими клонами в СПбНИИСВ ведется дальнейшая селекционная работа и отбор перспективных вариантов. Пребывание в космосе, также как и хранение в земных условиях для дрожжей S. cerevisiae, служит определённым фактором отбора клонов с нужными свойствами.

8. В результате полученных экспериментальных данных по лиофильно высушенной биомассе из ампулы №8, пенал № 18, экспонировавшейся на МКС в течение 10 месяцев (июль 2006г. – апрель 2007г.), после предварительного пребывания в космосе в течение 1 недели (экспедиции МКС-12 – МКС-13), были отобраны клоны, показавшие повышенную активность HBs- антигена вируса гепатита В. Из этих клонов была приготовлена экспериментальная серия вакцины гепатита В, соответствующая всем показателям качества и обладающая высокой активностью: уровень экспрессии Hbs-антигена был выше среднего на 30 %.

9. В процессе наземной селекции космических мутантов планируется стабилизировать свойства продуцентов HBs-антигена, провести депонирование этих клонов в музее производственных штаммов и на их основе отработать промышленную технологию производства вакцины против гепатита В для нужд здравоохранения.

Сроки проведения: 2006-2008 гг.
Состояние эксперимента: Завершен
Организация постановщик: Открытое акционерное общество "Биопрепарат" (ОАО "Биопрепарат", г.Москва), сопостановщик - ФГУП СПбНИИ вакцин и сывороток ФМБА.
Организации участники: НПП «БиоТехСис», РКК «Энергия», ФГБУ НИИ ЦПК им. Ю.А.Гагарина.
Научный руководитель: Картель Н. Т.
Публикации по эксперименту:

Список публикаций в процессе редактирования.

Последнее обновление: 14.11.2017

Информационная справка

Программы

Изображения